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獸藥工程中心院士工作站專(zhuān)家團(tuán)隊(duì) 科研成果展示研發(fā)動(dòng)態(tài)

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獸藥殘留檢驗(yàn)方法

時(shí)間：2014-09-19 來(lái)源：迅達(dá)康

　　近年來(lái),隨著獸藥的種類(lèi)和應(yīng)用規(guī)模劇增，特別是抗生素在畜牧生產(chǎn)中的應(yīng)用增加,由此導(dǎo)致的動(dòng)物性食品中獸藥殘留問(wèn)題日益突出人們對(duì)獸藥殘留問(wèn)題也日益關(guān)注。獸藥殘留分析是復(fù)雜混合物中痕量組分的分析技術(shù)。殘留分析既需要精細(xì)的微量操作手段,又需要高靈敏的痕量檢測(cè)技術(shù),難度大、儀器化程度和分析成本高,分析質(zhì)量控制和分析策略(如篩選性分析、確證性分析)有特殊要求。現(xiàn)對(duì)獸藥殘留分析中分離和檢測(cè)技術(shù)現(xiàn)狀及發(fā)展動(dòng)向做一簡(jiǎn)要介紹。

　1　樣本前處理

　1. 1　提取

　提取是使用適當(dāng)溶劑將待測(cè)物連同部分樣本基質(zhì)從固態(tài)樣本轉(zhuǎn)至易于凈化或分析的液態(tài),通常可除去99%的樣本雜質(zhì)。根據(jù)樣本的性質(zhì)選擇溶劑,如脂肪或水分含量。使用水溶性有機(jī)溶劑(乙腈、甲醇、丙酮等)有許多優(yōu)點(diǎn):溶劑和動(dòng)物樣本易混合,提取速度快;溶劑溶解作用強(qiáng);提取液pH值可以調(diào)節(jié),適用范圍廣;提取的同時(shí)兼脫蛋白和脫脂;待測(cè)物在樣本提取液中均勻分布,可只移取部分上清液或?yàn)V液進(jìn)行分析,無(wú)需

　反復(fù)提取將待測(cè)物全部轉(zhuǎn)出。

　1. 2　凈化

　凈化即將待測(cè)物與提取液中的樣本干擾雜質(zhì)分離。前處理中凈化的工作量最大,但一個(gè)具有強(qiáng)大分離效能或高選擇性檢測(cè)能力的測(cè)定體系可大大降低對(duì)凈化的要求。獸藥殘留分析中常用的凈化方法是液- 液分配和固相萃取。

　1. 2. 1　液- 液分配

　液- 液分配屬經(jīng)典的凈化手段。等體積的分配體系中溶質(zhì)分配平衡后溶解在非極性或極性較弱的溶劑中溶質(zhì)的百分比稱(chēng)為p值,利用p值可以選擇萃取系統(tǒng)、計(jì)算萃取次數(shù)和抽出率。通過(guò)調(diào)節(jié)溶液的pH值、極性、離子對(duì)形成等手段選擇性地改變待測(cè)物的p值是常用的凈化方法,如組織中磺胺類(lèi)藥物的凈化[ 1 ]。多數(shù)獸藥屬有機(jī)酸或有機(jī)堿類(lèi)化合物,離子對(duì)萃取法在獸藥殘留分析中有重要價(jià)值。

　1. 2. 2　固相萃取

　固相萃取作為凈化手段,其基本原理與開(kāi)放式柱色譜相同。固相萃取中樣本與微細(xì)顆粒填料(Φ70～150μm)接觸面積大,凈化速度快,分離效能高;操作簡(jiǎn)便,溶劑用量少,回收率高。所以近年來(lái)固相萃取發(fā)展很快。吸附層析常用的填料如硅膠、氧化鋁,因其吸附性能受自身和樣品的含水量影響很大,需嚴(yán)格控制。大孔樹(shù)脂(聚苯乙烯)為一種反相吸附劑,可直接凈化含水試樣。分配層析中常用的反相填料為鍵合有十八烷基(C18)或辛烷基(C8)的硅膠,是目前應(yīng)用最普遍的固相萃取技術(shù)。

　基質(zhì)固相分散(matrixsolid - phasedispersion, MSPD ) 是1989年由美國(guó)Louisiana州立大學(xué)的S A Barker教授首次提出并給予理論解釋的一種嶄新的固相萃取技術(shù)。其基本操作是將樣本直接與適量反相填料(C18或C8)研磨、混勻,制成半固態(tài)裝柱、淋洗。作為樣本凈化技術(shù),它具有直接處理樣本的優(yōu)點(diǎn),快速的分離過(guò)程和較高的分離效能,特別適宜于多殘留組分快速分離和分析自動(dòng)化。MSPD的簡(jiǎn)單操作中濃縮了傳統(tǒng)的樣本前處理中所需的樣本勻化、組織細(xì)胞裂解、提取、凈化等過(guò)程,但避免了樣本勻化、轉(zhuǎn)溶、乳化、濃縮和靜電造成的待測(cè)物損失;凈化后的樣品可直接進(jìn)行測(cè)定,測(cè)定速度快(十幾分鐘) ,所用有機(jī)溶劑量減少(幾十毫升) 。

　1. 2. 3　薄層色譜( TLC)

　TLC作為樣本凈化手段具有直觀、速度快、樣本容量大和分離效能高(顆粒Φ30～50 μm)等優(yōu)點(diǎn)。但對(duì)紫外- 可見(jiàn)區(qū)無(wú)吸收的待測(cè)物卻難以定位,有些待測(cè)物可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)品顯色來(lái)解決。

　1. 3　濃縮

　濃縮是待測(cè)物富集或轉(zhuǎn)溶的常用方法。前處理中以濃縮過(guò)程待測(cè)物損失最大。應(yīng)避免樣品液被直接蒸干,否則待測(cè)物可能附著于器皿上或與樣本基質(zhì)結(jié)合使回收率下降,高極性待測(cè)物如磺胺類(lèi)藥物較為嚴(yán)重。

　1. 4　衍生化

　衍生化提高檢測(cè)的靈敏度和選擇性已成為殘留分析中衍生化的最主要目的,如給待測(cè)物連接強(qiáng)電負(fù)性基團(tuán)以適于氣相色譜的電子捕獲檢測(cè)器檢測(cè)、HPLC的紫外或熒光衍生化等。

　HPLC衍生化分為柱前和柱后衍生化。柱后衍生化需要專(zhuān)門(mén)的反應(yīng)裝置(高壓泵、混合及反應(yīng)管道) ,待測(cè)物從色譜柱流出后與衍生化試劑反應(yīng),再進(jìn)入檢測(cè)器。其突出優(yōu)點(diǎn)是在線反應(yīng),動(dòng)態(tài)檢測(cè),無(wú)需反應(yīng)進(jìn)行完全,不影響現(xiàn)有的分離條件;主要不足是衍生化試劑可能對(duì)檢測(cè)有干擾,對(duì)流動(dòng)相亦有限制。

　2　測(cè)定方法

　2. 1　氣相色譜法

　氣相色譜法有許多高靈敏、通用性或?qū)Ｒ恍詮?qiáng)的檢測(cè)器供選用,如氫焰離子化檢測(cè)器( FID) 、氮磷檢測(cè)器(NPD)等,檢測(cè)限一般為μg/kg級(jí)。但是大多數(shù)獸藥極性或沸點(diǎn)偏高,需繁瑣的衍生化步驟,限制了GC的應(yīng)用。所以, 20 世紀(jì)80 年代后HPLC的發(fā)展速度超過(guò)GC,相當(dāng)數(shù)量的獸藥采用或改用HPLC進(jìn)行分析,如氯霉素、磺胺類(lèi)藥物等。

　2. 2　高效液相色譜法

　幾乎所有的化合物包括高極性/離子型待測(cè)物和大分子物質(zhì)均可用HPLC進(jìn)行測(cè)定。HPLC的分離機(jī)制與常規(guī)柱色譜相同,但填料更加精細(xì)(Φ5～10μm) ,可重復(fù)進(jìn)樣,分析速度快。HPLC至今仍缺乏可滿(mǎn)足獸藥殘留分析要求的通用型檢測(cè)器。紫外檢測(cè)器(UVD)最普及,其次是熒光檢測(cè)器和電化學(xué)檢測(cè)器。光二極管陣列檢測(cè)器是近十年來(lái)HPLC最重要的突破。DAD可同時(shí)接收整個(gè)光譜區(qū)的信息,在色譜峰流出同時(shí)能進(jìn)行每個(gè)瞬間的動(dòng)態(tài)光譜掃描并快速采集信號(hào),經(jīng)計(jì)算機(jī)處理后得到色譜- 光譜的三維圖譜,信息量大大增加。一次進(jìn)樣可得到每個(gè)組分峰的定量、定性和純度信息, 靈敏度亦明顯提高。大部分抗生素在高于230 nm的光譜區(qū)無(wú)吸收,而在低于230 nm的紫外區(qū)許多樣本基質(zhì)和流動(dòng)相產(chǎn)生干擾,需衍生化后測(cè)定,限制了紫外檢測(cè)器的應(yīng)用。旋光檢測(cè)有以下特點(diǎn):(1)選擇性高,樣本僅需簡(jiǎn)單提取即可;(2)靈敏度高,利用He- Ne激光作光源,靈敏度可達(dá)5～10μg水平;(3)可同時(shí)得到流出組分的比旋度,用以定性。目前,該方法已用于紅霉素、慶大霉素、羧芐青霉素和吩羧青霉素殘留的測(cè)定。

2. 3　高效薄層色譜(HPTLC)

　HPTLC的出現(xiàn)使TLC進(jìn)入了復(fù)興時(shí)期,現(xiàn)已成為僅次于HPLC和GC的殘留分析方法。HPTLC的斑點(diǎn)原位掃描定量、定性和高效分離材料(Φ3～10μm) 。改變了常規(guī)TLC在靈敏度和重現(xiàn)性方面的不足,但保持了TLC的簡(jiǎn)便、快速和樣品容量大的優(yōu)點(diǎn),可使用正相或反相板,分辨率幾乎與HPLC相當(dāng)。HPTLC在獸藥殘留的快速篩選性檢測(cè)方面應(yīng)用廣泛。

　2. 4　超臨界流體色譜( SFC)

　SFC可彌補(bǔ)GC和HPLC的不足,但不可能取代二者。SFC最大優(yōu)點(diǎn)是可以方便地連接各種靈敏的檢測(cè)器(MS, ECD等) ,如豬組織中磺胺類(lèi)藥物等抗菌素殘留的SFC -MS分析。

　2. 5　毛細(xì)管區(qū)域電泳(CZE)

　CZE是20世紀(jì)90 年代以來(lái)研究最活躍的分析技術(shù)之一。1989年開(kāi)始有商品出售。CZE不同于傳統(tǒng)的凝膠電泳技術(shù), CZE使用直徑僅25～50μm的毛細(xì)管而不用載體,待測(cè)組分在高壓(20～30 kV)下泳動(dòng),截面積小,熱量和泳速均勻。所以, CZE兼有高壓電泳的高速、高分辨和HPLC靈活、高效的優(yōu)點(diǎn),柱效高達(dá)106塔板/m。向電解質(zhì)中加入超臨界膠束濃度的表面活性劑,如十二烷基硫酸鈉( SDS) ,即為毛細(xì)管膠束電動(dòng)色譜( cap illarymi - cellarelectrokineticchromatography,CMEC) ,分離范圍可擴(kuò)展至中性或兩性分子,分離效能亦進(jìn)一步提高。CZE將在簡(jiǎn)化樣本前處理、多殘留分析和分析自動(dòng)化方面發(fā)揮重要作用。目前CZE的主要問(wèn)題是樣品量太小,限制了檢測(cè)的靈敏度。CZE - MS可能是最好的解決辦法。

　2. 6　聯(lián)用技術(shù)

　各種分析技術(shù)聯(lián)用是現(xiàn)代獸藥殘留分析乃至整個(gè)分析化學(xué)方法上的發(fā)展特點(diǎn)。計(jì)算機(jī)的應(yīng)用加速了這一趨勢(shì)。聯(lián)用技術(shù)可揚(yáng)長(zhǎng)避短,一般兼分離、定量和定性(分子結(jié)構(gòu)信息)于一體,因而特別適用于確證性分析。常見(jiàn)的聯(lián)用技術(shù),如TLC- MS、GC - MS、LC - MS、CZE - MS、LC - NMR、SFC - MS等。

　TLC - MS是最簡(jiǎn)單的離線聯(lián)用技術(shù)。GC - MS已相當(dāng)成熟,應(yīng)用相對(duì)較多。但這些聯(lián)用儀價(jià)格昂貴,遠(yuǎn)不如HPLC或GC那樣普及。MS無(wú)疑可作為HPLC的通用型檢測(cè)器。使用微型柱(15 ×0. 3 cmid)和適宜的接口技術(shù),如熱噴霧( TSP) 、微粒束( PB)等解決了LC與MS的連接問(wèn)題;使用軟電離技術(shù),如快原子轟擊( FAB) 、場(chǎng)解吸( FD)等解決了難氣化物質(zhì)的離子化問(wèn)題。LC - MS現(xiàn)在已進(jìn)入實(shí)用階段,其靈敏度較熒光檢測(cè)器高1個(gè)數(shù)量級(jí),能方便地對(duì)ng級(jí)的獸藥殘留組分進(jìn)行檢測(cè)與結(jié)構(gòu)確證。

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